油桐枯萎病病原鉴定及其生物学特性研究

工作。

用无菌剪刀在病健交界处剪取约1 cm2组织块，70%酒精中浸1 s后在01%升汞中消毒180～240 s，无菌水换洗3次。用无菌镊子将其移至PDA（马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂17 g，蒸馏水1 000 mL）平板培养基上，每皿均匀分布3～5段。翻转培养皿，使皿底向上，置于25 ℃恒温箱中。培养2～3 d后，将植物组织周围长出的菌丝体转接至新的PDA平板上进行纯化。观察记录各纯化菌株培养性状后保存于4℃冰箱备用。

1.2致病性测定

依据柯赫氏法则，测试各纯化菌株的致病性。油桐健康叶片源自湖北省林科院九峰油桐示范林。剪取健康叶片，放入保鲜盒中，取长满平皿的菌丝块紧贴在叶片表面，对照组加无菌培养基块，25 ℃恒温培养，保持90%相对湿度。48 h后观察叶片发病情况，并记录发病症状。将发病叶片进行组织分离，获得再分离菌株，与原接种菌株进行比较。

1.3病原菌鉴定

将病原物接种在PDA平板上，25 ℃培养3 d，观察记录菌落形态特征，主要包括生长速度、菌丝颜色、是否有气生菌丝、菌落结构及色素产生情况等。挑取菌丝体，在光学显微镜下观察菌丝体形态、产孢结构、厚垣孢子的有无和产生方式及分生孢子形态、颜色、大小等特征。参考文献资料＼[8-9＼]对病原菌形态进行鉴定。

病原物基因组提取采用微波炉裂解法。核糖体DNA内转录间隔区（ITS1-5.8S-ITS2）基因扩增采用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[10]。PCR扩增反应条件为：94℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，36次循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR 产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。病原物ITS基因序列进行BLAST比对后获得多个匹配的序列记录，用CLUSTAL X软件包进行多序列比对。

1.4病原菌生物学特性研究

1.4.1温度对病原菌菌丝生长的影响

将保存备用的菌株在25 ℃恒温箱中预培养3 d，于菌落边缘打取直径为5 mm的菌饼，接种于PDA平板上，分别置于10，15，20，25，30，35，40 ℃恒温箱中培养，每个处理重复3次，4 d后用十字交叉法测量菌落直径。

1.4.2pH值对病原菌菌丝生长的影响

用1 mol·L-1HCL和1 mol·L-1NaOH调节PDA培养基的pH值至4，5，6，7，8，9（酸度计测量pH值）。按1.4.1所述方法分别接种菌饼于不同pH值PDA培养基，置于25℃恒温箱中培养。每个处理重复3次，4 d后测量菌落直径。

湖北林业科技第45卷第5期徐红梅，等：油桐枯萎病病原鉴定及其生物学特性研究1.4.3碳源和氮源对病原菌菌丝生长的影响

以查彼培养基为基础培养基（硝酸钾20 g，磷酸氢钾10 g，氯化钾05 g，硫酸镁05 g，硫酸亚铁001 g，蒸馏水1 000 mL）。供试碳源为葡萄糖300 g，甘露醇276 g，可溶性淀粉2455 g，麦芽糖2725 g，蔗糖259 g，果糖2725 g（用量以葡萄糖300 g含碳量109 g为标准进行换算），灭菌后接种，以无碳源处理作为对照。每个处理重复3次，置于25 ℃恒温箱中培养，4 d后测量菌落直径。

供试氮源为硝酸钾100 g，尿素30 g，硫酸铵66 g，甘氨酸75 g，硝酸铵40 g（用量以硝酸钾100 g的含氮量14 g为标准进行换算），灭菌后接种，以无氮源处理作为对照。每个处理重复3次，置于25 ℃恒温箱中培养，4 d后测量菌落直径。

1.4.4不同杀菌剂对病原菌菌丝生长的毒力测定

在无菌操作条件下，将供试杀菌剂分别用无菌水稀释成所需浓度10倍于供试浓度的5个系列浓度梯度的药液。向培养皿中加入药液1 mL，再加入9 mL冷却至50～60 ℃的PDA培养基，充分混匀，最终配制成所需浓度的含药培养基，以不含药剂的培养基作为对照，每个浓度重复4次。供试药剂和使用浓度见表1。

采用生长速率法对菌丝生长进行室内毒力测定[11]：在每个含药剂平板中央接入一块直径为5 mm的菌饼，25 ℃恒温箱中培养4 d后测量菌落直径，根据以下公式计算各药剂浓度对菌丝生长的抑制率。所得数据经SPSS170统计软件进行数据处理，求出各药剂毒力回归方程、EC50及相关系数。

抑菌率（%）=对照菌落直径-处理菌落直径对照菌落直径-菌饼直径×100%表1供试药剂和使用浓度表杀菌剂名称生产厂家使用浓度/（μg·mL-1）125%氟环唑悬乳剂西班牙巴斯夫欧洲公司50，25，125，625，31343%戊唑醇悬乳剂澳大利亚拜耳作物科学公司25，125，625，313，1650%多菌灵超微可湿性粉剂山东绿丰农业有限公司125，625，313，16，0870%代森锰锌可湿性粉剂山东富先达农药有限公司250，125，625，3125，156275%百菌清可湿性粉剂山西华农生物化学有限公司100，50，25，125，6252结果和分析

2.1病原物分离培养

病叶组织在PDA平板上培养3 d后即可见菌丝在其边缘长出。经过纯化后共获得5个纯培养菌株。

2.2致病性测定

对5个菌株进行致病性测定，结果显示1个菌株对油桐健康叶片有强致病性。叶片接种3 d后出现褐色病斑，病斑形状不规则，在25 ℃恒温和高湿环境下，病斑扩展迅速，15 d后部分供试嫩叶整叶褐化坏死。发病叶片组织分离后所得再分离菌株与接种菌株特征一致，符合柯赫氏法则。

2.3病原菌鉴定

该强致病力菌株气生菌丝发达，白色绒絮状，有明显的分枝和分隔，能分泌紫红色素。产生大小两型分生孢子。作者结合病原物培养性状、形态学特征和rDNAITS基因序列比对结果将其初步鉴定为尖镰孢Fusarium oxysporum。

2.4病原菌生物学特性

2.4.1温度对病原菌菌丝生长的影响

结果表明，该菌在10～40 ℃温度范围均能生长，25～30 ℃菌丝生长较快，其中25 ℃为最适生长温度，培养4 d后菌落平均直径为850 mm。高温和低温均不利于菌丝生长。当温度低于10 ℃或者高于40 ℃时，菌丝生长速度缓慢（图1）。

2.4.2pH值对病原菌菌丝生长的影响

结果表明，该菌可以在pH值4～9范围内生长，pH值5～7时菌落生长速度较快，其中pH值为6是最适生长pH值，菌落平均直径为563 mm。pH值大于7时，随着pH值的升高，菌落的生长速度逐渐降低（图2）。

2.4.3碳源和氮源对病原菌菌丝生长的影响

该菌在供试5种碳源培养基中均能生长，菌落直径远大于缺碳对照，在蔗糖培养基上菌落直径最大，平均直径为686 mm，其次是甘露醇、葡萄糖、淀粉和麦芽糖。不同碳源培养基上菌落培养性状差异不大，蔗糖为该菌菌丝生长的最佳碳源（图3）。

从图4可以看出：该菌在供试5种氮源培养基中均能生长，菌落直径大于缺氮对照，在硝酸钾培养基上生长速度最快，菌落平均直径达到407 mm，其次是甘氨酸、硝酸铵、硫酸铵和尿素。不同氮源培养基上菌落培养性状差异不大，硝酸钾为该菌菌丝生长的最佳氮碳源。

2.4.4不同杀菌剂对病原菌菌丝生长的影响

室内毒力测定结果表明，供试5种杀菌剂对该病原菌毒力不同，从大到小依次为：50%多菌灵超微可湿性粉剂﹥43%戊唑醇悬乳剂﹥125%氟环唑悬乳剂﹥75%百菌清可湿性粉剂﹥70%代森锰锌可湿性粉剂。50%多菌灵超微可湿性粉剂对该病原菌的抑制效果最好，70%代森锰锌可湿性粉剂效果最差，各杀菌剂对油桐枯萎病的室内毒力测定结果见表2。表2供试药剂对油桐枯萎病病原菌毒力测定结果处理毒力回归方程相关系数EC50/（μg·mL-1）12.5%氟环唑悬乳剂y=0.591x+4.2060.95822.0243%戊唑醇悬乳剂y=0.556x+4.1120.87911.4150%多菌灵超微可湿性粉剂y=7.960x+0.2670.81753.9270%代森锰锌可湿性粉剂y=0.447x+4.0320.975144.4975%百菌清可湿性粉剂y=1.008x+3.1580.95367.053结论与讨论

本文对湖北省武陵山区油桐枯萎病开展了病原菌分离与鉴定、致病性测定、病原菌生物学特性等研究，为该病害的发生规律和防治研究提供理论依据。组织分离所获得的5个菌株经致病性测定，有1个菌株为油桐枯萎病强致病菌。依据该强致病病原菌形态学特性及rDNA-ITS序列比对结果，鉴定油桐枯萎病的病原菌为尖镰孢。生物学特性研究表明，该病原菌在10～40 ℃温度范围均能生长，最适生在温度为25～30 ℃；病原菌在pH值4～9可以生长，pH值5～7时菌落生长速度较快，表明病原菌在酸性、中性和碱性土壤条件下均能生长，但在弱酸性条件下生长最好。该病原菌能利用环境中的多种碳源和氮源，蔗糖和硝酸钾分别为该菌菌丝生长的最佳碳源和氮源，因此在生产管理中应注意合理施肥。总体说来，油桐枯萎病病原菌对环境适应能力很强，该生物学特性为其容易侵染和传播奠定了基础。

室内毒力测定结果表明，供试5种杀菌剂对该病原菌毒力不同。毒力较强杀菌剂为：50%多菌灵超微可湿性粉剂、43%戊唑醇悬乳剂和12.5%氟环唑悬乳剂；毒力较差杀菌剂为：75%百菌清可湿性粉剂和70%代森锰锌可湿性粉剂。生产过程中可以参考本研究结果，选择50%多菌灵超微可湿性粉剂等杀菌剂防治油桐枯萎病。

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