责任公司)、多功能粉碎机(北京兆易科技有限公司)。
试验所需试剂:葡萄糖为色谱纯试剂,无水乙醇、苯酚、浓硫酸、碳酸钠、碳酸钡、铁氰化钾均为分析纯试剂。
试验所用中国芦荟取自福建省福州市晋安区一农场。
1.2 多糖提取方法
取成熟新鲜的中国芦荟整株,洗净,先掰下芦荟叶,取得根茎,芦荟叶剥皮,刮下叶内胶体部分,分别将芦荟凝胶、叶皮、整叶和根茎打浆混匀。分别称取10.0 g样品3份,加无水乙醇,静置沉淀12 h,4000转/min离心15 min,弃去上清液,再加80%乙醇溶液30 mL,搅拌清洗滤液,4000转/min离心15 min,弃去上清液。滤渣加80℃左右的热水100 mL,搅拌提取20 min,过滤得滤液,滤渣用热水洗3次,合并滤液,定容至500 mL,得4种不同部位的芦荟多糖提取液。
1.3 测定方法
1.3.1 苯酚—硫酸显色反应法 精确称取葡萄糖100.0 mg,置100 mL容量瓶中,蒸馏水溶解定容至刻度,得1000 μg/mL葡萄糖标准储备液。准确移取标准液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL,分别置于50 mL容量瓶中,加水至刻度。分别取上述溶液1.0 mL置10 mL具塞试管中,加1.0 mL 5%苯酚溶液(取3.2 mL 80%苯酚,用水定容至50 mL容量瓶中,必须现配现用)。加入5.0 mL浓硫酸,注意移液管必须垂直于液面上10 cm左右的距离,不碰壁,匀速加入试管中。摇匀,室温静置30 min,以试剂空白为参比,在490 nm波长处测定吸光度,以吸光度A对浓度C(μg/mL)作回归方程。
1.3.2 电化学差示脉冲伏安法 精确移取上述1.3.1的1000 μg/mL葡萄糖标准储备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL分别置于50 mL的容量瓶中,加水定容,摇匀。分别取上述溶液各2.0 mL置于10 mL具塞试管中,各管再加入5 mmol/L K3Fe(CN)6溶液2.0 mL(准确称取K3Fe(CN)6 0.0825 g与Na2CO3 0.53 g,用二次蒸馏水溶解转移至50 mL容量瓶中稀释至刻度),混匀,置沸水浴中反应15 min,冷却至室温。将试管中反应液分别移入10 mL容量瓶中,加入蒸馏水稀释至刻度,摇匀,转入电解池中。每次测量前通高纯度N2 5 min以除去溶液中的O2, 将预处理的电极浸入电解液中开路搅拌富集2 min,静置10 s,记录从-0.2 ~ +0.8 V电位测定葡萄糖标准液的差示脉冲伏安曲线,以空白溶液测定所得曲线进行背景校正,测量其氧化峰电流,以氧化峰电流Ip对浓度C(μg/mL)作直线回归。
1.4 精密度试验
分别平行取10份等体积的芦荟整叶的多糖提取液,5份用于苯酚-硫酸法显色后测定吸光度,5份用于电化学法测定氧化峰电流。
1.5 回收率试验
精密量取芦荟凝胶的多糖提取液10 mL于25 mL容量瓶中,同样的提取液做4份,再分别加入1000 μg/mL葡萄糖标准溶液0.5、0.8、1.0、1.5 mL于容量瓶中,加水至刻度。分别取这4种溶液按上述的苯酚—硫酸法和电化学法做回收试验。
2 结果与分析
2.1 线性回归方程
苯酚—硫酸显色法以吸光度A对浓度C作回归方程,得A=0.0093C+0.0158,r=0.9992。葡萄糖标准溶液在20~200 μg/mL范围内,吸光度对标准溶液浓度呈良好的线性关系。
电化学差示脉冲伏安法以氧化峰电流Ip对浓度C作回归方程,得Ip=0.2247C-4.789,r=0.9905。标准溶液浓度在30~90 μg/mL范围内,氧化峰电流对标准溶液浓度呈良好的线性关系。
2.2 精密度试验
分别通过5次平行试验(表1),苯酚—硫酸显色法的RSD为2.03%,电化学差示脉冲伏安法的RSD为2.98%,两种方法精密度试验结果均良好。
2.3 回收率试验
对4种不同含量的葡萄糖标准溶液做加标回收试验,测定结果见表2和表3。苯酚—硫酸显色法的回收率96.64%~101.30%,平均为99.06%;电化学差示脉冲伏安法的回收率100.70%~110.30%,平均为104.50%,两者均满足芦荟多糖含量的测定要求。
2.4 两种方法测定芦荟不同部位多糖含量
精密量取1.2项中4种制备好的芦荟多糖提取液,按1.3和1.4项中的方法操作,根据各自的标准曲线计算,如超出线性范围稀释后再检测,通过稀释倍数计算含量,测定结果见表4。两种方法测定芦荟不同部位的多糖含量比较接近,且呈现相同的趋势:根茎的含量最高,叶片的皮次之,凝胶最少。
3 小结与讨论
关于苯酚—硫酸显色法测定多糖含量的报道[4-5]比较多,技术也比较成熟。本试验所采用的电化学差示脉冲伏安法检测芦荟不同部位多糖,该方法比较少见报道。试验结果表明,两种方法的线性、精密度和回收率都符合要求,样品的检测结果没有显著差异,均适用于芦荟多糖的检测。但是二者相比较,苯酚—硫酸法的操作更简便,成本更低,线性范围更大一些。
本试验对中国芦荟不同部位多糖的提取和测定表明,芦荟中根茎的多糖浓度最高,叶皮次之,其次是整叶,凝胶最少。由于凝胶的含水量高,多糖的浓度相对低,但凝胶是芦荟整株中的精华和比重最大的部分,它所含的多糖也是最优质的。芦荟的叶皮和根茎的多糖含量较高,说明芦荟的叶皮和根茎也是生产和储藏多糖的重要器官。为了提高多糖的得率,可以考虑整叶提取多糖。
参考文献:
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