甘草黄酮对UVB损伤HDF细胞保护作用研究

工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、DK2000ⅢL型电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）、移液器（100～1 000 μl）、YB1201DW型电子天平（上海海康电子仪器厂）、85 K离心机（上海安亭科学仪器厂）、MS500A型半自动生化分析仪（四川美生科技有限公司）、MK3型酶标仪（上海热电仪器有限公司）、TGL16GC 型高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2方法

1.2.1药物与试剂配制。

1.2.1.1药物的配制。通过预试验发现甘草黄酮浓度>10-9mol/L 时对HDF细胞产生毒性，该试验将甘草黄酮加入FM培养液中，配制成高、中、低（10-9、10-10 、10-11mol/L）3个浓度，调pH为7.0，0.22 μm孔径滤膜滤过除菌，-20 ℃保存待用。

1.2.1.2 培养液的配制。培养液按照FM培养液∶胎牛血清∶双抗=89∶10∶1的比例配制，混匀后，4 ℃保存待用。

1.2.1.3MTT溶液的配制。称取250 mg MTT，放入小烧杯中，加45 mL PBS（无Ca2+、Mg2+离子，pH=7.2），在50 ℃水浴中搅拌溶解，50 mL容量瓶定容至50 mL，用0.22 μm孔径滤膜过滤除菌分装，-20 ℃保存待用。

1.2.2HDF细胞的复苏。从液氮灌中取出冻存管后，迅速投入37 ℃水浴的同时摇动冻存管，使其快速溶解，移入超净工作台中，将冻存的细胞悬液移入一无菌的离心管，同时向该离心管中加入3～4 mL新鲜FM培养液，混匀，1 500 r/min离心3 min，弃去上清，加入3～4 mL新鲜FM培养液吹悬细胞，转入新的培养瓶中，放入37 ℃、5%CO2培养箱中进行培养，次日更换培养液，继续培养。

1.2.3HDF细胞的体外培养。HDF细胞在含有10%胎牛血清的FM培养液中，37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下进行培养，待细胞呈现80%～90%融合时进行处理。

1.2.4细胞分组及给药。接种于96孔板内的细胞分为空白对照组、模型组以及甘草黄酮高（10-9 mol/L）、中（10-10 mol/L）、低（10-11 mol/L）剂量组，每组设6个复孔。空白对照组：细胞加入FM培养液，培养48 h；模型组：培养24 h的细胞弃培养液，每孔加入150 μL PBS，采用30 mJ/cm2 的UVB照射细胞，弃PBS，加入不含药的FM培养液继续培养24 h；甘草黄酮组：细胞加入FM培养液，培养24 h后，弃培养液，每孔加入150 μL PBS，采用30 mJ/cm2 的UVB照射细胞，弃PBS，加入含不同浓度（10-9、10-10、10-11 mol/L）甘草黄酮的FM培养液继续培养24 h。

1.2.5指标检测。

1.2.5.1细胞中GSHPx、SOD活性和MDA含量。按照各试剂盒说明书，取细胞上清液进行测定。

1.2.5.2细胞活性。取5 mg/mL的MTT 20 μL加入至96孔板中，将其放入CO2 培养箱中孵育4 h后弃上清液加入150 μL的二甲基亚砜（DMSO），在恒温培养振荡器内振荡10 min，在492 nm处测定各孔吸光度值（OD值）。按公式计算细胞活性：细胞活性=OD试验组/OD对照组×100%。

1.3数据处理用SPSS17.0软件对数据进行统计分析，数据均以±s表示，多样本间的方差分析采用LSD法。

2结果与分析

2.1甘草黄酮对HDF细胞活性的影响由表1可知，与空白对照组比较，模型组细胞活性明显降低，两者具有统计学意义（P<0.01），表示细胞光老化模型建立成功；甘草黄酮组与模型组比较，不同浓度的甘草黄酮组（10-9、10-10、10-11mol/L）分别不同程度地提高了细胞活性（P<0.01、P<0.05），表明甘草黄酮能抑制UVB辐射引起HDF细胞的氧化损伤。

2.2甘草黄酮对HDF细胞中GSHPx、SOD活性的影响由表2可知，与空白对照组比较，模型组的GSHPx、SOD活性明显降低，两者具有统计学意义（P<0.01），表示模型建立成功；甘草黄酮组与模型组比较，不同浓度的甘草黄酮组（10-9、10-10、10-11mol/L）分别不同程度地提高了GSHPx、SOD活性（P<0.01、P<0.05），表明甘草黄酮能抵抗UVB辐射引起HDF细胞的氧化损伤。

2.3甘草黄酮对HDF细胞中MDA含量的影响由表2可知，与空白对照组比较，模型组的MDA含量明显上升，两者具有统计学意义（P<0.01），表示模型建立成功；甘草黄酮组与模型组比较，10-9、10-10、10-11mol/L甘草黄酮作用于細胞时，明显降低了MDA的含量（P<0.01、P<0.05），表明甘草黄酮能抵抗UVB辐射引起的MDA外漏。

3讨论与结论

活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）是一组具有未配对电子的原子或分子，包括超氧阴离子（superoxide anion，O2- ）、单线态氧（singlet oxygen，1O2）、过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）、羟基自由基（hydroxyl free radical，·OH）等。正常情况下，人体内ROS的产生与消除处于平衡状态，当ROS增多时，细胞内的GSHPx、SOD、CAT等抗氧化酶可快速清除ROS，维持机体促氧化-抗氧化的平衡，但随着机体衰老或受某些外界因素（紫外线）影响时，会打破平衡状态，机体受到多余ROS的伤害。

GSHPx是一种含硒酶，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成，可以调节硒消耗和形成，具有清除过氧化物和保护细胞免于氧化损伤的重要作用，能够解除过氧化氢的毒性，恢复氧化变性的大分子。SOD是最有效的超氧化自由基清除剂，可以有效预防或延缓皮肤老化。MDA是一种能够引起胶原蛋白长度缩短、性状发生变化的脂质过氧化产物，对细胞具有毒性。该试验以30 mJ/cm2的UVB照射HDF细胞，HDF细胞活性下降，细胞内谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）、超氧化物歧化酶（SOD）活性下降，丙二醛（MDA）含量上升。试验结果证明，甘草黄酮浓度为10-9 mol/L时，细胞活性显著升高；随着甘草黄酮浓度的增加（10-11、10-10 、10-9 mol/L），细胞GSHPx、SOD活性随之增加，MDA含量降低，中药甘草的主要活性成分甘草黄酮可能抑制氧化损伤、提高SOD活性，在防治皮肤光老化方面具有一定作用。

参考文献

[1] NAYLOR E C，WATSON R E，SHERRATT M J. Molecular aspects of skin ageing[J].Maturitas， 2011，69（3）：249-256.

[2] EPE B.DNA damage spectra induced by photosensitization[J].Photochemical & photobiological sciences， 2012，11（1）： 98-106.

[3] 徐慧，刘健航，陈向东，等.非光暴露皮肤经窄谱中波紫外线照射前后MMP-1的表达[J].中国皮肤性病学杂志，2009，23（1）：11-12.

[4] CENCIONI C，SPALLOTTA F，MARTELLI F，et al.Oxidative stress and epigenetic regulation in ageingand agerelated diseases[J].Int J Mol Sci，2013，14（9）： 17643-17663.

[5] WU B H，LONG C G，WANG X M，et al.The scavening effect of flavonoids of Glycyrrhiza on hydroxyl radical studied in vitro[J].J North Sichuan Med Coll，2001，16（1）：3-5.

[6] 葉怀义，龚赋岚，尚明，等.甘草黄酮抗衰老作用的研究[J].哈尔滨商业大学学报，2004，20（1）：93-97.