黄芩提取物对H22移植瘤小鼠的影响

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摘要：目的 探讨黄芩提取物对肝癌H22模型小鼠的抑瘤作用及其可能的作用机制。方法 将H22瘤株接种于小鼠，建立移植瘤模型。造模成功后随机分为模型组、5-Fu组及黄芩提取物低、中、高剂量组，另取12只正常小鼠作为对照组。各给药组给予相应药物灌胃，观察给药后小鼠体质量，计算肿瘤抑制率、胸腺及脾脏指数，分光光度法检测血清总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量，单细胞凝胶电泳检测外周血淋巴细胞DNA损伤。结果 黄芩提取物中、高剂量对肿瘤生长有显著抑制作用。与5-Fu组比较，黄芩提取物中、高剂量组能显著提高小鼠体质量、胸腺和脾脏指数，提高血清T-AOC、SOD活性，降低MDA含量，减轻外周血淋巴细胞DNA损伤。结论 黄芩提取物具有明显的抗肿瘤作用，其作用机制可能与减轻肿瘤对机体正常组织细胞的伤害、修复或增强小鼠的免疫功能，以及提高机体抗氧化损伤能力有关。

关键词：黄芩提取物；抗肿瘤；抗氧化；免疫功能；DNA损伤；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.10.013

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）10-0041-04

Abstract：Objective To study the antitumor effects of Scutellaria Radix extracts on H22 transplanted tumor in mice and its possible mechanism. Methods The H22 transplanted mouse models were established by inoculating H22 to mice. 60 mice were randomly divided into model group， 5-Fu group， low-， medium- and high-dose Scutellaria Radix extracts groups， with 12 normal mice as control group. All administration groups received gavage with relevant medicine. And then the body weight change， tumor growth inhibitory rate， and spleen and thymus indexes were calculated；the T-AOC and activities of SOD， and MDA content in serum were detected by spectrophotometer；DNA damage of peripheral blood lymphocytes was observed by single cell gel electrophoresis. Results Medium- and high-dose Scutellaria Radix extracts can significantly inhibit the growth of transplanted tumor. Compared with 5-Fu group， medium- and high-dose Scutellaria Radix extracts groups notably increased the body weight， spleen and thymus indexes of mice， promoted T-AOC and activities of SOD， and decreased MDA content in serum， as well as notably reduced DNA damage of peripheral blood lymphocytes. Conclusion Scutellaria Radix extracts have obvious antitumor effects on H22 transplanted tumor in mice and the possible mechanisms may be due to lightening the damage of normal tissue and cell from tumor， enhancing immunologic function and improving antioxidant capability of H22 bearing mice.

Key words：Scutellaria Radix extracts；antitumor；antioxidant；immunologic function；DNA damage；mice

目前，临床上治疗肝癌的一线药物主要是化疗药物，这类药物普遍存在毒副反应大的缺点，在杀伤肿瘤细胞的同时对患者体内正常细胞、组织器官也造成极大的损伤。因此，研究毒副反应小、又能有效控制肿瘤发展的药物，已逐步成为抗肿瘤药物开发的思路。黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，研究表明，黄芩具有抗菌消炎、抗病毒、清除自由基、抗氧化等作用[1-4]。本实验采用肝癌H22移植瘤小鼠模型，探讨黄芩提取物对模型小鼠的抑瘤作用及其可能的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物及细胞株

SPF级2月龄昆明种小鼠72只，雌雄各半，体质量（20±2）g，甘肃中医药大学实验动物中心，合格证号SCXK（甘）2011-0001。小鼠肝癌H22瘤株，中国医学科学院药物研究所。

1.2 药物

2年生黄芩根，11月初采自甘肃陇西，经甘肃中医药大学杜弢教授鉴定为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。将黄芩用蒸馏水洗净后切片，置于烘箱（40 ℃）烘干至恒重，研碎后过60目筛备用。70%乙醇加热回流3次，每次回流2 h，将3次提取液合并浓缩至无醇味，再用蒸馏水调至1∶1浓度，4 ℃冰箱保存。分光光度法测得黄芩总黄酮含量为19.48%。氟尿嘧啶注射液（5-Fu），规格：250 mg/10 mL，上海旭东海普药业有限公司，批号20131210。

1.3 试剂

考马斯亮蓝、总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒，南京建成生物工程研究所；正常熔点的琼脂糖、低熔点的琼脂糖，美国Sigma公司；台盼蓝、三羟甲基氨基甲烷、二甲基亚砜、溴化乙锭均为国产分析纯。

1.4 仪器

DYY-Ⅲ型电泳仪，北京六一仪器厂；CKX41-F32FL荧光倒置显微镜，日本奥林巴斯公司；VIS-723N型紫外可见分光光度计，北京瑞利分析仪器有限公司。

2 实验方法

2.1 H22移植瘤模型制备

常规方法复苏H22小鼠肝癌细胞，取0.2 mL细胞悬液注射到小鼠腹腔内，连续传2代。无菌操作取第2代腹水，0.4%台盼蓝染色，计数活细胞率>90%，再用无菌生理盐水稀释，调整细胞密度为1×107个/mL，取0.2 mL瘤细胞悬液接种到60只昆明种小鼠的右前肢腋窝皮下。

2.2 分组及给药

接种后第2日，将60只小鼠，雌雄各半，随机分为模型组、5-Fu组和黄芩提取物低、中、高剂量组，每组12只。另取12只正常小鼠设为对照组。黄芩提取物低、中、高剂量组每日分别以50、100、200 mg/kg剂量给予小鼠黄芩提取物灌胃，每日1次；5-Fu组按25 mg/kg剂量隔日灌胃给药1次；对照组和模型组每日给予0.2 mL/10 g生理盐水灌胃。每日记录小鼠的活动状况及体质量变化。连续10 d。

2.3 检测指标

末次给药后，禁食不禁水16 h，各组小鼠称重，摘眼球取血，脱颈处死小鼠。

2.3.1 抑瘤率和脏器指数测定 剖取瘤块，生理盐水洗净表面残血，称重，计算抑瘤率[（模型组平均瘤质量-给药组平均瘤质量）÷模型组平均瘤质量×100%]。剖取胸腺和脾脏，生理盐水洗净表面残血，用滤纸吸干，电子天平称重，计算脏器指数。脏器指数=脏器质量÷体质量。

2.3.2 血清总抗氧化能力、超氧化物歧化酶活性及丙二醛含量测定 分离血清，4 ℃冷藏保存，用于T-AOC、SOD活性、MDA含量的测定。SOD活性测定采用黄嘌呤氧化酶法；MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法（TBA）法；比色法检测血清T-AOC，组织蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法，具体测定流程按试剂盒说明书进行。

2.3.3 外周血淋巴细胞DNA损伤检测 采用单细胞凝胶电泳法，具体流程参照Singh等[5]描述的方法稍加改进，选择尾长、尾矩、Olive尾矩为DNA损伤指标。

3 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 黄芩提取物对移植瘤小鼠肿瘤生长的影响

与模型组比较，不同剂量黄芩提取物对肝癌H22移植瘤小鼠瘤质量均有一定的抑制作用，其中黄芩提取物中、高剂量组抑瘤作用显著（P<0.01）；黄芩提取物各剂量组小鼠瘤质量均明显高于5-Fu组（P<0.01），黄芩提取物各剂量组抑瘤率均低于5-Fu组。结果见表1。

4.2 黄芩提取物对移植瘤小鼠体质量及免疫器官指数的影响

与模型组比较，实验末期5-Fu组小鼠体质量明显下降（P<0.01），黄芩提取物中、高剂量组小鼠体质量则有所增加，黄芩提取物中、高剂量组小鼠胸腺和脾脏指数明显升高（P<0.05，P<0.01），5-Fu组小鼠胸腺指数和脾脏指数明显降低（P<0.01），也明显低于黄芩提取物中、高剂量组（P<0.01）。结果见表2。

4.3 黄芩提取物对移植瘤小鼠血清抗氧化指标的影响

与对照组比较，模型组、5-Fu组、黄芩提取物各剂量组小鼠血清T-AOC均明显降低（P<0.01）；与模型组比较，黄芩提取物中、高剂量组小鼠血清T-AOC明显升高（P<0.01），而5-Fu组小鼠血清T-AOC明显降低（P<0.01）。模型组、5-Fu组、黄芩提取物各剂量组小鼠血清SOD活性均低于对照组，其中模型组、5-Fu组、黄芩提取物低剂量组与对照组比较差异显著（P<0.01）；黄芩提取物各剂量组小鼠血清SOD活性均高于5-Fu组，其中中、高剂量组差异有统计学意义（P<0.01）。与对照组比较，模型组、5-Fu组、黄芩提取物各剂量组小鼠血清MDA含量均明显升高（P<0.01），黄芩提取物中、高剂量组血清MDA含量明显低于模型组（P<0.01）。结果见表3。

4.4 黄芩提取物对移植瘤小鼠外周血淋巴细胞DNA损伤的影响

与对照组比较，模型组、5-Fu组、黄芩提取物各剂量组小鼠外周血淋巴细胞DNA尾长、尾矩、Olive尾矩均增加，除黄芩提取物高剂量组DNA尾长外，其余各组差异均有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，黄芩提取物中、高剂量组小鼠外周血淋巴细胞DNA尾长、尾矩、Olive尾矩均明显降低（P<0.01），而5-Fu组小鼠外周血淋巴细胞DNA尾长、尾矩、Olive尾矩则明显升高（P<0.01）。结果见表4。

5 讨论

恶性肿瘤是一类危害人类健康的常见疾病，居人类疾病病死率的第1位。在肿瘤疾病的治疗中，化疗可改善临床症状，提高生存质量及延长生命。化疗药物在杀死大量肿瘤细胞的同时，对机体的正常组织和细胞也有不同程度的损伤作用，主要表现在可引起免疫器官萎缩、免疫功能减退、造成正常淋巴细胞大量减少、产生一定的细胞毒性等。因此，在最大限度杀灭肿瘤细胞的同时，修复或增强机体的免疫功能，减轻对正常组织和细胞毒害作用，是治疗肿瘤的关键所在。

本实验结果表明，不同剂量黄芩提取物对小鼠H22肝癌移植瘤生长均有明显抑制作用，黄芩提取物的抑瘤作用弱于5-Fu；但不同的是，5-Fu组小鼠体质量明显减轻，胸腺指数和脾脏指数显著下降，而黄芩提取物中、高剂量组体质量、胸腺指数和脾脏指数下降不明显，表明黄芩提取物用药安全性较好。黄芩提取物中、高剂量组小鼠胸腺指数和脾脏指数显著高于模型组，表明黄芩提取物中、高剂量能够在一定程度上改善肿瘤对机体免疫器官的伤害，修复或增强小鼠的免疫功能。

研究表明，自由基产生和消除失衡与肿瘤发生、发展关系密切。当机体处于肿瘤的发生、发展等病理过程中，机体抗氧化能力减弱，自由基产生速度超过了机体清除的能力，机体内累积过多的自由基可直接损伤DNA，也可通过脂质过氧化产物间接损伤DNA。当DNA损伤累积到一定程度后可导致细胞功能改变、基因毒性及肿瘤启动等多种损伤[6-8]。本实验结果显示，模型组小鼠血清T-AOC、SOD活性显著降低，MDA含量显著升高，外周血淋巴细胞DNA尾长、尾矩、Olive尾矩明显增加，表明肿瘤的发生对机体造成了氧化损伤。给予中、高剂量黄芩提取物后，移植瘤小鼠T-AOC、SOD活性明显升高，MDA含量显著降低，外周血淋巴细胞DNA尾长、尾矩、Olive尾矩明显降低，提示黄芩提取物中、高剂量可改善或提高机体的抗氧化能力，以清除体内过多产生的自由基，进而保护淋巴细胞DNA结构的稳定。

综上所述，黄芩提取物具有明显的抗肿瘤作用，其作用机制可能与减轻或改善肿瘤细胞对机体正常组织细胞的伤害、修复或增强小鼠的免疫功能及提高机体抗氧化损伤能力有关。与常规化疗药物相比，黄芩提取物在一定剂量下对小鼠无明显不良影响，是其优势所在。然而肿瘤的形成和发展十分复杂，涉及多个脏器，多种生化指标的改变，单纯依靠黄芩提取物治疗，并不能完全控制肿瘤的生长，是否可以将黄芩提取物与化疗、放疗联用，以增强对肿瘤的控制效果，延长移植瘤小鼠生存时间，还有待进一步探讨。

参考文献：

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（收稿日期：2015-01-23）

（修回日期：2015-02-12；编辑：华强）