大理州烟草黑胫病菌对烯酰吗啉的敏感性测定

���m��ڞ'(�&�i�v�N4�O4��w������v ۿ饨ky"http://www.996site.com/keyLists/gongzuo.html" target="_blank" class="keylink">工作。E-mail：huyanxia_a@126.com。*通信作者，E-mail：zhijianzhao@hotmail.com

收稿日期：2014-07-18 修回日期：2015-01-09

全、高效的杀菌剂进行合理的替代或轮换。

烯酰吗啉是羧酸氨基类杀菌剂，主要用于防治卵菌纲病原菌引起的葡萄霜霉病、白菜霜霉病、番茄晚疫病、马铃薯晚疫病、辣椒疫病、荔枝霜疫霉病、大豆疫霉根腐病等，是一种新型的高效内吸性杀菌剂，对疫霉属具有独特的作用方式[8-9]，是继甲霜灵之后防治卵菌病害的又一理想杀菌剂，国外普遍应用于防治烟草黑胫病。近年来，我国烟区已开始使用烯酰吗啉类杀菌剂对该病害进行防治[7]。因此研究烟草黑胫病菌田间菌株对烯酰吗啉的敏感性及其抗药性风险，对预测病原菌抗药群体的发展动态和制定抗性治理策略具有重要的意义。本研究首次分析了云南大理州烟草黑胫病菌对新型杀菌剂烯酰吗啉的敏感性，旨在建立烟草黑胫病菌对烯酰吗啉的敏感性基线，并对大理州烟草黑胫病菌的抗药性水平进行监测，以期为田间抗药性风险的评估和抗性治理提供理论依据，指导烟草安全生产。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

用于烟草黑胫病菌分离培养的培养箱为上海一恒生化培养箱（LRH-250F），培养条件为25 ℃黑暗培养。超净工作台为上海智诚ZHJH-C1112B型超净工作台。

1.2 供试菌株

供试烟草黑胫病菌菌株68个。2013年从云南省大理州种植烤烟品种“红花大金元”的10个县市的不同烟区采集具有黑胫病典型症状的病株，于加有抗生素的选择性黑麦培养基（RSA）上分离纯化所得。所有烟草黑胫病菌菌株黑暗保存于10 ℃菌种保存柜。

1.3 供试药剂

供试的95%烯酰吗啉原药用分析纯丙酮溶解，配制成10 μg/mL贮液，保存于4 ℃冰箱中备用。

1.4 烯酰吗啉敏感基线的建立

根据地域的差异，从不同烟区选出11个菌株用含药平板法进行烯酰吗啉敏感性测定。供试菌株在黑麦培养基上25 ℃黑暗培养5～7 d后，分别配制含烯酰吗啉0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 µg/mL的8个不同浓度梯度的V8培养基平板。用直径为5 mm的打孔器在相同圆周的菌落边缘上切取菌饼，将菌饼正面朝下，分别接种到含烯酰吗啉系列浓度梯度的V8培养基平板上，每处理3次重复，置于25 ℃恒温培养箱中黑暗培养3 d后，用十字交叉法测量菌落生长直径。根据菌落直径计算出生长量，计算烯酰吗啉各浓度梯度对黑胫病菌菌丝生长抑制的百分率（%），抑制率（%）=[（对照菌落生长直径-处理菌落生长直径）/对照菌落生长直径]×100%。通过DPS软件，将药剂浓度转化成对数（x），抑制率转化成机率值（Y），建立其毒力回归方程Y=Bx+A，根据x与Y的线性关系计算出相关系数（r）、烯酰吗啉抑制菌丝生长50%的有效质量浓度（EC50值），确定供试菌株对烯酰吗啉的敏感性基线。

1.5 烟草黑胫病菌对烯酰吗啉的敏感性测定

基于烟草黑胫病菌对烯酰吗啉的敏感性基线，选择适宜的浓度梯度，分别配制相应的烯酰吗啉含药平板，测定其余57个菌株对烯酰吗啉的抗药性水平。

2 结 果

2.1 烟草黑胫病菌对烯酰吗啉敏感基线的建立

从表1可以看出，挑取的11个云南大理烟草黑胫病菌对烯酰吗啉的EC50范围在0.9556～

1.8924 μg/mL，最不敏感菌株130401A与最敏感菌株13112对烯酰吗啉的敏感性相差了约2.0倍，平均EC50值为1.4656 μg/mL，表明烯酰吗啉对烟草黑胫病菌的活性较高，云南大理不同地理来源的烟草黑胫病菌菌株对该药剂的敏感性没有明显的差异，烯酰吗啉对大理州烟草黑胫病菌有很好的抑制作用。根据测定的烟草黑胫病菌对烯酰吗啉的敏感性结果，以田间敏感群体的EC50平均值1.4656μg/mL作为大理州烟草黑胫病菌对烯酰吗啉的敏感性基线。

2.2 大理州烟草黑胫病菌对烯酰吗啉敏感性测定

根据建立的烟草黑胫病菌对烯酰吗啉的敏感性基线，选择含药0.0、0.5、1.0、2.0、4.0 μg/mL的5个浓度梯度，测定2013年从大理州分离纯化的烟草黑胫病菌菌株对烯酰吗啉的敏感性。从表2可看出，大理州10个县市的红花大金元烟区分离获得的烟草黑胫病菌对烯酰吗啉的EC50值在0.5857～2.5254 μg/mL，平均EC50为

1.1118 μg/mL，表明烟草黑胫病菌对烯酰吗啉的EC50值还相对较低，均为敏感菌株，烯酰吗啉在生产上对烟草黑胫病有很好的防控效果。分离自大理州不同红花大金元产区的烟草黑胫病菌对烯酰吗啉的敏感性没有显著差异，各菌株对烯酰吗啉的抗药性水平不存在地理上的差异，但值得注意的是漾濞县、云龙县和大理市的烟草黑胫病菌EC50值相对其他区域稍高，在今后应采取合理的措施进行黑胫病防控及不同杀菌剂的合理轮换施用，避免长期单一地使用某一类杀菌剂对病原菌群体造成选择压力而导致杀菌剂对烟草黑胫病防治失效。

3 讨 论

鉴于烯酰吗啉在防治烟草黑胫病上的应用，目前国内陆续开展了烯酰吗啉对烟草黑胫病菌的敏感性、生物活性及防治效果方面的相关研究。如汪汉成等[10]报道烯酰吗啉对烟草黑胫病菌菌丝生长和孢子囊形成具有很高的抑制作用。胡燕等[11]采用菌丝生长速率法测定了烯酰吗啉对烟草黑胫病菌的毒力，结果表明，20个山东和云南田间菌株的EC50值在0.60～1.28 μg/mL，均属于敏感菌株。苏凯等[12]测定了贵州省47个烟草黑胫病菌对烯酰吗啉的敏感性，发现烯酰吗啉对烟草黑胫病菌菌丝生长和孢子囊形成的抑制基本一致，对菌丝EC50范围为0.7926～4.2327 μg/mL，平均2.4768 μg/mL。朱桂宁等[13]报道烯酰吗啉与甲霜灵没有交互抗性，而且50%烯酰吗啉可湿性粉剂对烟草黑胫病的防效显著优于常用药剂68%精甲霜灵·代森锰锌水分散粒剂。

本研究建立了云南省大理州烟草黑胫病菌对烯酰吗啉的敏感性基线，并对大理州10个县市的红花大金元烟区分离获得的烟草黑胫病菌的抗药性水平进行了监测，结果显示大理州68个烟草黑胫病菌对烯酰吗啉的EC50值在0.5857～

2.5254 μg/mL之间，平均为1.1118 μg/mL，抗药性水平与山东省烟草黑胫病菌对烯酰吗啉的EC50值在0.60～1.28 μg/mL之间类似[11]，但明显低于贵州省烟草黑胫病菌的抗药性水平，表明大理州烟草黑胫病菌对烯酰吗啉较为敏感，烯酰吗啉对烟草黑胫病菌有很好的抑制作用，可成为甲霜灵等苯酰氨类杀菌剂的理想替换药剂用于云南烟草黑胫病的防治。目前在法国已经检测到葡萄霜霉病菌对烯酰吗啉的抗性菌株，证实了烯酰吗啉存在抗性风险[8]。因此应注意在烟草生产中要合理地进行有效药剂的轮换，不要长期单一施用烯酰吗啉类杀菌剂，以免对病原菌造成较大的选择压力，增加抗药性风险。

4 结 论

大理州烟草黑胫病菌田间菌株对烯酰吗啉的EC50值在0.5857～2.5254 μg/mL，平均为

1.1118 μg/mL。烯酰吗啉对烟草黑胫病菌的活性较高，各菌株对烯酰吗啉的敏感性在地理上没有明显的差异，大理州烟草黑胫病菌的抗药性风险较低。烯酰吗啉可成为甲霜灵等苯酰氨类杀菌剂的理想替换药剂，用于大理州烟草黑胫病的有效防控，但应与其他无交互抗性的杀菌剂进行合理的轮换使用。

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